摘 要：為鑒定獼猴桃果實貯藏過程中參與果膠降解的關鍵酶多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因，以‘徐香’獼猴桃為試材，利用轉錄組測序（RNA-seq）和實時熒光定量（qRT-PCR）技術，研究了獼猴桃 PG基因在不同成熟進程及外源乙烯誘導后果實中的表達變化。根據(jù) RNA-seq 結果，可以將 37 個 PG 基因在采后不同時期的表達趨勢分為 4 類，Achn325011、Achn240441、Achn071601 和 Achn100411，分別在采后 2、4、6 和 8 d 有表達高峰。鑒于果實硬度在常溫貯藏 6 d 較 4 d 時急劇下降，因此利用 qRT-PCR 重點驗證了其中的 2 類 14 個基因，發(fā)現(xiàn) 4 個基因在采后 2 d 和 4 d 明顯上調，與果實硬度在 6 d 時的下降相關。進一步利用外源乙烯處理果實，發(fā)現(xiàn)其中 1 個基因 Achn071601 在處理與對照果實中的差異表達與同時期果實硬度的變化趨勢一致，是獼猴桃關鍵的 PG 基因。
關鍵詞：獼猴桃；貯藏；轉錄組測序；PG 基因
▲獼猴桃結果像葡萄一樣多了
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實，有明顯的生理后熟過程，采后果實質地易軟化，影響其商品性（許淼 等，2017）。因此，探討獼猴桃果實成熟軟化機理具有重要意義。研究表明，果實后熟過程中的硬度下降與細胞壁相關酶的活性有關，因此在生產中常用外源藥劑處理抑制獼猴桃采后果實中這些酶的活性，從而延長貯藏期（丁建國 等，2003；李佩燕 等，2013；李樺 等，2017）。陳昆松等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃果實采收時，β–半乳糖苷酶基因表達水平最高，隨后呈下降趨勢。雖然 β–半乳糖苷酶基因的表達可為外源乙烯所誘導，但在果實乙烯躍變期間卻沒發(fā)現(xiàn) β–半乳糖苷酶基因顯著的表達變化。Zhang 等（2006）利用獼猴桃表達序列標簽數(shù)據(jù)庫克隆了脂氧合酶 Lox 基因家族 6 個成員，發(fā)現(xiàn)它們在獼猴桃果實成熟過程中具有不同的表達譜，AdLox1 和 AdLox5 對乙烯敏感，表達水平隨果實內源乙烯積累趨于增強，與 Lox 酶活性表現(xiàn)一致；同樣，這兩個基因表達可被外源乙烯所誘導，而其余 4 個成員則對乙烯不敏感。楊紹蘭等（2007）克隆了獼猴桃的 α-expansin（EXP）基因，Northern 雜交結果表明 AdEXP1 在采收當天的果實中表達很弱，隨著果實成熟衰老進程加快而表達趨于增強。
▲獼猴桃包裝盒
多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是果膠酶的一種，通過催化果膠分子的解聚，促進果實軟化（魏瀟 等，2011）。目前關于 PG 活性增強與果實成熟軟化的關系已經(jīng)在番茄、蘋果（劉靜軒 等，2017）、梨、葡萄、桃、柿（宋康華 等，2010）和香蕉等多個樹種上得到證實，也在這些樹種上分離出了大量 PG 基因（高曉銘 等，2016）。在獼猴桃上，Wang 等（2000）克隆了 3 個 PG基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，其中 CkPGA 和 CkPGB 在果實和花瓣上均有表達，而 CkPGC 則僅在成熟果實表達，其表達量可以達到 CkPGA 和 CkPGB 的 50 倍。陳義挺等（2017）以‘米良 1號’獼猴桃果實為材料，研究了室溫、低溫和脫落酸處理下獼猴桃果實硬度的變化，同時對 AcPG的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn) AcPG 參與了獼猴桃果實軟化過程。
▲獼猴桃開花授粉
隨著高通量測序技術的發(fā)展，轉錄組測序（RNA-Seq）作為一種高效便捷的基因表達分析手段，在不少研究中得到廣泛應用。高潔（2013）利用轉錄組測序對黃肉獼猴桃‘金豐’果實著色過程中相關差異基因的表達進行了解析，發(fā)現(xiàn)果實成熟期與轉色期之間有 1 457 個差異表達基因，其中 12個調控葉綠素合成及 14 個調控類胡蘿卜素合成的基因可能與該黃肉獼猴桃的呈色機理有關。Tang等（2017）對獼猴桃雄性和雌性花進行了轉錄組測序，共鑒定出 2 503 個差異表達的基因，其中 1 793個基因在雌花中表現(xiàn)為上調，710 個下調。
▲正在采摘獼猴桃雄花
目前獼猴桃的 PG 基因多數(shù)從表達序列標簽庫或者同源序列克隆獲得，可能導致鑒定到的基因并不全面。為了從轉錄組水平研究 PG 基因與獼猴桃果實硬度變化的關系，以中國獼猴桃主栽品種‘徐香’為試材，在果實成熟后進行常溫貯藏，對貯藏后不同時期的果肉進行轉錄組測序，鑒定其中 PG 基因的表達，并分析 PG 與硬度變化的關系，為發(fā)掘獼猴桃中果實質地性狀形成相關的 PG 基因，解析獼猴桃果實成熟軟化的分子機制奠定研究基礎。
▲獼猴桃苗
1 材料與方法
1.1 試驗材料及其貯藏期間果實硬度測定
2016 年 9 月，自獼猴桃主產區(qū)河南省西峽縣一商品果園采摘 6 年生‘徐香’獼猴桃（Acinidiachinensis）大小一致、無病蟲害的成熟果實，迅速運至實驗室，常溫貯藏（25 ℃、濕度約 60%）。
貯藏 2、4、6 和 8 d，分別取 6 ~ 8 個果實，去皮，采用 FT327 型果實硬度計（Fruit TestTM，意大利）測定果實去皮硬度，隨后取混合果肉至液氮冷凍后–80 ℃保存，供提取 RNA。
1.2 外源乙烯處理試驗
2017 年 10 月，采摘獼猴桃果實，以乙烯利（購自中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所果樹生長發(fā)育調控中心）為外源乙烯處理的試劑（濃度為 500 mg · kg-1），浸果 3 min，取出晾干，室溫保存。在處理后 1 ~ 7 d，每天采用 TA-XT plus 型質構儀（Stable Micro Systems，英國）測定果實去皮硬度，探頭直徑 5 mm，測定速度 2.0 mm · s-1，下降位移 5.0 mm。另取樣冷凍保存?zhèn)溆锰崛?RNA。
1.3 RNA 提取及反轉錄
利用多糖多酚植物 RNA 提取試劑盒（華越洋公司，北京）提取果肉 RNA，加 DNaseⅠ（TaKaRa公司，大連）去除 DNA，利用瓊脂糖電泳和 NanoDrop 2000（Thermo，Waltham，MA，USA）檢測RNA 的純度，利用 Ist Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA 公司，大連）進行反轉錄合成單鏈 cDNA。
▲Golden Kiwi
1.4 RNA-seq
利用單鏈 cDNA、dNTPs、RNase H 和 DNA polymeraseⅠ合成雙鏈 cDNA，添加接頭，純化并構建測序文庫，在 HiSeq 2500（Illumina，San Diego，CA，USA）上進行測序，試劑全部來自 Illumina公司。測序結果去除接頭和低質量序列后，利用 TopHat 2（Kim et al.，2013）軟件將序列比對至參考基因組（Huang et al.，2013），基因表達量采用 FPKM（Fragments per kb per million reads）值表示。
1.5 熒光定量 PCR 驗證
根據(jù)果實硬度的變化，選擇 14 個在采后處理中期有明顯上調的基因采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法進行 RNA-seq 結果的驗證，目的基因和內參 Actin 基因特異引物見表 1。qRT-PCR 反應試劑盒購自 TaKaRa 生物技術公司，按照說明書添加適量的 cDNA 模板、引物和熒光染料，在 ABI7900HT 實時定量 PCR 儀（ABI，Carlsbad，CA，USA）上進行反應。程序為 95 ℃3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。參考 Livak & Schmittgen（2001）的方法，根據(jù)原始 Ct 值計算目的基因的相對表達量。
▲zespri yellow kiwi
2 結果與分析
2.1 PG 基因在染色體上的分布
獼猴桃有 29 條染色體，根據(jù)基因組功能注釋結果（Huang et al.，2013），PG 基因共 37 個，分布在 17 條染色體（圖 1），其中第 17 號染色體有 4 個，第 6、7、12、18 和 20 號染色體各有 3 個，其他染色體上分布的較少。PG 基因在單個染色體上的分布也沒有明顯規(guī)律，在第 6、7、11、13、15、17、18 和 20 號染色體上存在 2 個基因成對排列的現(xiàn)象，其余基因則彼此之間距離較遠。
2.2 常溫貯藏過程中果實硬度的變化
如圖 2 所示，常溫貯藏 2 d 和 4 d，果實硬度差異不大，4 d 時為 13.56 kg · cm-2。隨著貯藏時間的延長，果實硬度明顯下降，貯藏 6 d時果實硬度為 2.01 kg · cm-2，僅為貯藏初期的14.8%；貯藏 8 d 與 6 d 時相比變化不明顯。
▲紅心獼猴桃套果袋
2.3 常溫貯藏過程中 PG 基因的表達變化在果實貯藏過程中，轉錄組測序共檢測出25 109 個表達的基因。其中貯藏 2 d 時表達基因最多，達到 22 939 個；4 d 和 8 d 表達基因分別有 22 156 和 22 165 個；而 6 d 時（果實硬度顯著下降）表達基因最少，僅有 21 670。根據(jù) PG基因的全基因組注釋，37 個 PG 基因中，僅有 28個基因檢測到有表達的轉錄本，這 28 個基因在不同貯藏期的相對表達量變化如圖 3 所示。根據(jù) 28 個 PG 基因在貯藏后不同時期的表達趨勢，將它們分成 4 類（圖 3），即 1、2、3、4類基因分別在貯藏 6、8、2 和 4 d 有明顯表達。由于獼猴桃果實硬度在貯藏 2 和 4 d 差異不大，6和 8 d 之間差異也不明顯，僅在 6 d 有明顯下降。鑒于基因表達變化可能出現(xiàn)在表型變化之前，所以推測第 1 類（貯藏 6 d 明顯表達）和第 4 類（貯藏 4 d 明顯表達）基因可能與果實的硬度下降相關。
為驗證 RNA-seq 得到的基因表達結果，選擇第 1 類中的 6 個基因（Achn080501、Achn208711、Achn071601 、 Achn228271 、 Achn032311 和Achn144331）和第 4 類的 8 個基因（Achn032321、Achn240441 、 Achn114381 、 Achn184431 、Achn057911 、 Achn236671 、 Achn118371 和Achn100771）進行了 qRT-PCR 分析（圖 4）。
▲Health Benefits of Kiwi Fruit
從 圖 4 可以看出， 3 個 第 1 類基因（Achn208711、Achn228271 和 Achn032311）和4 個第 4 類基因（Achn032321、Achn057911、Achn236671 和 Achn118371），利用 RNA-seq 得到的基因 FPKM 值均小于 1，表明該類基因表達量非常低，暗示其可能不是導致果實硬度降低的關鍵基因。另外的 3 個第 1 類基因（Achn080501、Achn071601 和 Achn144331）和 4 個第 4 類基因（ Achn240441 、Achn114381 、 Achn184431 和Achn100771），利用 RNA-seq 所得到的基因 FPKM 值均大于 1，與利用 qRT-PCR 得到的基因相對表達量的相關性分別為–0.193、0.996、0.931、–0.309、0.431、0.999 和 0.747，即除了 Achn080501和Achn240441之外，其余基因的表達結果在兩種方法間是比較一致的。其中，第4類基因Achn184431利用 qRT-PCR 和 RNA-seq 得到的相對表達量在貯藏第 4 天分別是第 2 天的 1.75 倍和 2.00 倍，而第4類基因Achn240441利用qRT-PCR和RNA-seq得到相對表達量在貯藏后第4天分別為第2天的0.94倍和 2.58 倍；2 個第 1 類基因 Achn071601 和 Achn144331 在 6 d 也較 4 d 明顯上調，利用 qRT-PCR得到的相對表達量分別達到 8.41 倍和 7.81 倍；該結果暗示這 4 個基因可能是導致‘徐香’獼猴桃果實硬度下降的關鍵基因。
▲sungold g3 陽光金果
2.4 外源乙烯對 PG 基因表達的誘導作用
PG 基因的表達通常受到乙烯的誘導（陳昆松 等，2000；Zhang et al.，2006）。對照果實在貯藏 1 d 和 5 d 時硬度快速下降，其他時期相對穩(wěn)定；而外源乙烯處理的果實硬度持續(xù)下降（圖 5）。
外源乙烯處理后的果實，上述 4 個表達差異較大的基因的表達變化如圖 6 所示。對照果實的 Achn184431 基因在貯藏 4 d 時有 1 個明顯的高峰，而外源乙烯處理的 Achn184431則隨著貯藏期的延長呈下降趨勢。在整個貯藏期，Achn184431 的表達量雖然在對照與處理間的個別時期差異不明顯，但總體趨勢顯示對照均高于乙烯處理，表明其不受外源乙烯的誘導。
▲紅心獼猴桃果園
對照的 Achn240441 基因在處理后 4 d 時有 1 個強度不明顯的表達高峰，而乙烯處理的Achn240441 的表達量峰值出現(xiàn)在 2 d 時。比較對照與處理果實中該基因的表達，顯示在貯藏 2 ~ 6 d內，對照高于處理，說明其與同時期處理的果實硬度下降無關。對照的 Achn144331 基因在貯藏 4 d 時出現(xiàn)表達高峰，而乙烯處理的果實貯藏 2、4 和 6 d 均低于對照，最高值出現(xiàn)在貯藏 7 d 時。由于外源乙烯處理與對照果實硬度變化最明顯的差異出現(xiàn)在乙烯處理后 4 d，因此，該基因在貯藏 7 d 的高表達可能與外源乙烯誘導無關。
Achn071601 基因在對照果實貯藏 6 d 時出現(xiàn)表達高峰，而在處理果實中隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，在 7 d 時表達最高。比較其在對照和處理果實中的表達，發(fā)現(xiàn)從采后 2 d 開始，Achn071601在處理果實的表達均高于對照，與同期果實硬度在處理和對照果實間的差異一致，暗示其可能是導致果實硬度下降的原因。
▲獼猴桃檢測活性
3 討論
在獼猴桃基因組測序和注釋完成之前，對關鍵基因的克隆多使用圖位克隆或者同源克隆的方法。圖位克隆依賴遺傳圖譜的構建和精細定位，進展緩慢；而同源克隆則可能只克隆到某個基因家族中的部分成員，遺漏全基因組的信息。如 Wang 等（2000）在獼猴桃中克隆的 3 個基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，分別對應獼猴桃基因組 Achn124031、Achn080501 和 Achn051381 基因。在本研究中，Achn124031 在‘徐香’獼猴桃果實中不表達，Achn080501 雖然有表達，但表達量較低，且qRT-PCR 顯示其在整個果實貯藏過程中變化不明顯；Achn051381 在果實貯藏 6 d 有表達，且隨著貯藏時間的延長持續(xù)上調，趨勢與 Wang 等（2000）的結果類似。然而 Achn051381 基因在貯藏 8 d 的FPKM 值僅為 1.33，表達量遠小于同時期本研究新鑒定的 2 個關鍵基因，如 Achn071601（59.18）和 Achn144331（10.25）。陳義挺等（2017）根據(jù)獼猴桃轉錄組數(shù)據(jù)庫克隆到 1 個 PG 基因 AcPG，該基因在獼猴桃‘米良 1 號’果實室溫貯藏 7 d 后表達水平急劇下降至貯藏前的 1/5。本研究中發(fā)現(xiàn)AcPG 基因對應 Achn118371，雖然 qRT-PCR 表明其在‘徐香’獼猴桃果實貯藏 6 d 后同樣較貯藏 2 d同樣有明顯下調，但表達量較低，可能并不是導致‘徐香’獼猴桃果實硬度下降的關鍵基因。
▲獼猴桃雄花展示
獼猴桃基因組測序于 2013 年完成（Huang et al.，2013），為全面系統(tǒng)地研究基因家族的所有成員提供了重要的基礎。在本研究中，基于基因組注釋結果可以看出，PG 基因共有 37 個，遠多于前人研究中所涉及的 PG 基因數(shù)量。利用 RNA-seq 結合 qRT-PCR 技術，本研究初步篩選出 4 個表達量較高且在果實常溫貯藏條件下硬度變化關鍵期發(fā)生明顯上調的 PG 基因；進一步通過外源乙烯處理獼猴桃果實，發(fā)現(xiàn)其中 Achn071601 的誘導表達與果實硬度的變化密切相關。
綜上所述，本研究利用 RNA-seq 技術從轉錄組層面鑒定出 4 個與果實硬度變化相關的 PG 基因，通過外源乙烯處理則推測 Achn071601 可能是‘徐香’獼猴桃中調控果實貯藏期果實硬度變化的重要候選基因。
▲獼猴桃電動授粉槍
Abstract：RNA-sequence and real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）technique （qRT-PCR）were used to identify the expression of key polygalacturonase（PG）genes involved in pectin degradation in kiwifruit，stored at room temperature at different time periods during storage. The expression pattern of 37 PG genes could be divided into 4 groups according to the RNA-sequence results of different samples stored at room temperature. For example，Achn325011，Achn240441，Achn071601 and Achn100411 genes present a peak expression at 2，4，6 and 8 days after harvest. Fourteen PG genes belonging to groups 1 and 4 were verified using the qRT-PCR as a decrease in fruit firmness on the 6 d after storage was observed. Among these PG genes，the expression of 4 genes was related to the fruit firmness change. Moreover，the expression of these 4 genes was also evaluated in kiwifruits treated with exogenous ethylene. The results of ethylene treatment showed that the expression of a single gene called Achn071601 was consistent with the fruit firmness change during the storage period. Therefore，Achn071601 should be considered as a key PG gene in kiwifruit.
Keywords：kiwifruit；storage；RNA-seq；PG gene
▲新西蘭的獼猴桃雄花園Kiwi Male Garden in New Zealand
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